Cập nhật lần cuối vào 06/04/2023

1. Kỹ thuật sắc ký

Kỹ thuật sắc ký là một quy trình cho phép tách riêng các chất tan trong hợp chất nhờ việc cho pha động chuyển động liên tục và trong pha này các chất riêng biệt thể hiện mức độ linh động khác nhau do có sự khác biệt về mức độ phân bố, hấp phụ, điện tích, … Các chất riêng biệt sau khi tách ra có thể được xác định bằng các phương pháp phân tích khác. Ưu điểm của phương pháp sắc ký là đơn giản và tách được các chất trong hỗn hợp nên được ứng dụng trong công tác nghiên cứu, phân tích và kiểm nghiệm thuốc.

2. Sắc ký cột

Sắc ký cột cổ điển được dùng để tách đơn chất ra khỏi hỗn hợp. Ngày nay đã có các phương pháp sắc ký cột cải tiến như sắc ký trên cột bằng chất dẻo, sắc ký cột nhanh tạo áp suất từ trên xuống, sắc ký cột chân không tạo áp suất phía dưới, sắc ký cột rây phân tử và sắc ký cột phân bố. Các phương pháp cải tiến giúp cho quá trình khai triển diễn ra nhanh hơn, việc lấy mẫu thuận tiện, nạp được nhiều mẫu hơn, loại được muối hoặc đường ra khỏi hỗn hợp, tinh chế sản phẩm, phân lập cấu trúc dựa vào kích thước. Nhìn chung trong việc kiểm nghiệm thuốc, phương pháp này đa phần sử dụng sắc ký cột cổ điển đồng thời ghép với các phương pháp khác để phát hiện cấu trúc của chất sau khi được tách.

Điều chế polyme in dấu phân tử lõi-vỏ cho lincomycin A và ứng dụng của nó trong cột sắc ký ².

Lincomycin là một loại kháng sinh có hiệu quả chống lại các sinh vật Gram dương. Trong quá trình sản xuất lincomycin, sản phẩm thu được có lincomycin A, B, C, D. Lincomycin A là sản phẩm chính, các sản phẩm còn lại là tạp chất. Lincomycin C rất ít và có cùng tác dụng dược lý với lincomycin A. Lincomycin B là thành phần tạp chất chính có hoạt tính thấp hơn và gây độc cao hơn lincomycin A. Vì vậy, hàm lượng của nó trong sản phẩm phải nằm trong giới hạn quy định. Để cải thiện quy trình sản xuất cần phải giảm hàm lượng lincomycin B trong nguyên liệu . Việc loại bỏ các chất tương tự B, C, D gặp nhiều khó khăn do chi phí cao, hiệu suất thấp và phải sử dụng đến các dung môi hữu cơ. Do đó tiến hành nhốt lincomycin A vào polyme nhằm dễ dàng tách riêng ra khỏi các chất tương tự. Sắc ký cột được dùng để đánh giá khả năng nhốt lincomycin A dựa vào sự thay đổi tốc độ dòng chảy. Đồng thời sử dụng sắc ký cột để tách riêng phức hợp polymer đã nhốt lincomycin A ra khỏi hỗn hợp.

3. Sắc ký lớp mỏng (TLC)

Sắc ký lớp mỏng là một phương pháp đơn giản, áp dụng để thử độ tinh khiết, giới hạn tạp chất, phát hiện tạp, định tính, bán định lượng và định lượng. Ứng dụng rộng rãi, có thể dùng để kiểm tra hiệu quả của quá trình chiết, tách, tinh chế. Sắc ký lớp mỏng có thể dùng để tìm các điều kiện tối ưu cho sắc ký lỏng trên cột do thiết bị đơn giản, lượng dung môi sử dụng ít, thời gian khai triển ngắn và sử dụng lượng mẫu rất ít. Nhược điểm của phương pháp là độ lặp lại thấp do hệ số R_f  (hệ số di chuyển) bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố trong quá trình sắc ký, pic bị dãn rông ra do tốc độ dòng dung môi pha động thấp. Để khắc phục vấn đề trên nhờ kỹ thuật sắc ký cao áp trên mặt phẳng – OPLC và sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao.

OPLC là phương pháp sử dụng áp suất để định hướng dòng chảy pha động dẫn đến tiết kiệm thời gian sắc ký, chất phân tích vẫn được đưa lên bản mỏng như TLC. OPLC thường được sử dụng chủ yếu trong sắc ký chế hóa. Khi so sánh giữa phương pháp TLC và OPLC để phát hiện một số thành phần đặc trưng của các loại tinh dầu, phương pháp OPLC cho thấy khả năng phát hiện tốt hơn đồng thời tốn ít dung môi và có độ lặp lại cao hơn ⁴.

Ví dụ về khả năng phát hiện tạp chất phân hủy trong viên nén methylprednisolon ³.

Bàn mỏng: Silica gel GF₂₅₄.

Dung môi khai triển: Dicloromethan – ether – methamol- nước (77 : 15 : 8 : l ,2).

Dung môi hòa mẫu: Cloroform – methanol (9 : 1).

Dung dịch thử: Lắc một lượng bột viên tương ứng với 20 mg methylprednisoỉon với 2 ml dung môi hòa mẫu trong 15 phút. Ly tâm và lấy dịch trong.

Dung dịch đối chiểu (ỉ): Pha loãng một thể tích dung dịch thử thành 50 thể tích bằng dung môi hòa mẫu.

Dung dịch dối chiếu (2): Pha loãng 1 thể tích dung dịch đối chiếu (1) thành 4 thể tích bằng dung môi hòa mẫu.

Dung dịch đối chiếu (3): Hòa tan 1 mg hydrocortison trong hỗn họp gồm 0,1 ml dung dịch thử và 0,9 ml methanol .

Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng 5 μl mỗi dung dịch trên. Triển khai sắc ký đến khi dung môi đi được 15 cm. Lấy bản mỏng ra và để khô ngoài không khí. Quan sát dưới ánh sảng tử ngoại ở bước sóng 254 nm. Bất kỳ vết phụ nào trên sắc ký đồ của dung dịch thử cũng không được đậm hơn vết thu được trên sắc ký đồ cùa dung dịch đối chiếu (1) (2 %) vả không có quá một vết như vậy đậm hơn vết thu được trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (2) (0,5 %). Phép thử chỉ có giá trị khi trên sẳc ký đồ của dung dịch đổi chiểu (3) có 2 vết chính gần nhau nhưng tách rời nhau.

4. Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC)

HPTLC là phương pháp cải tiến của TLC và OPLC nhằm khắc phục các nhược điểm của các phương pháp trước. Nhưng phương pháp OPLC vẫn phổ biến hơn HPTLC do tiết kiệm được thời gian phân tích, chọ được tốc độ pha động để tối ưu việc tách.

Tối ưu hóa và thẩm định quy trình để xác định doxycycline hyclate trong công thức viên nang và viên nén bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) ⁵.

Chuẩn bị dung dịch chuẩn: Dung dịch tiêu chuẩn của doxycycline được chuẩn bị bằng cách hòa tan một lượng chất chuẩn tương đương với 15 mg doxycycline hyclate trong 50 mL methanol và sau đó bổ sung hỗn hợp acetonitril-metanol (30:70 thể tích/thể tích) tới vạch 100 mL.

Chuẩn bị dung dịch mẫu: Cân 20 viên chế phẩm viên nang hoặc viên nén doxycycline hyclate tính khối lượng trung bình và nghiền trộn đều. Cân một lượng tương đương với 15 mg doxycycline được chuyển vào bình định mức 100 mL và thêm 50 ml methanol lắc đều và sau đó đặt trong bể siêu âm trong 10 phút. Dịch chiết đã lọc được chuyển vào bình định mức 100 mL và pha loãng đến vạch bằng acetonitril-metanol (30:70 70 thể tích/thể tích).

Điều kiện thiết bị và sắc ký: Thiết bị Camag HPTLC bao gồm dụng cụ lấy mẫu Linomat V (Camag, Muttenz, Thụy Sĩ), ống tiêm 100 μL (Hamilton-Bonaduz Schweiz, Camag, Thụy Sĩ), TLC Scanner III (Camag, Muttenz, Swtzerland), phần mềm winCATS phiên bản 1.4.0 (Camag , Muttenz, Thụy Sĩ) đã được sử dụng trong nghiên cứu. Sắc ký được thực hiện trên Merck silica gel 60 F 254các tấm TLC tráng trước (20 cm × 20 cm với độ dày 200 μm; số lô: HX389048 và HX398477), giấy bão hòa (Camag, Muttenz, Thụy Sĩ) được sử dụng cho các buồng phát triển bão hòa. Các mẫu được áp dụng thành các dải dưới dòng nitơ bằng cách sử dụng ống tiêm μL. Quá trình phát triển tăng dần đến khoảng cách 7 cm được thực hiện trong buồng phát triển TLC 20 × 20 cm 2 máng đôi bão hòa trước 30 phút (Camag). Các bản mỏng đã chấm mẫu được làm khô bằng máy sấy tóc. Quét mật độ và đánh giá định lượng được thực hiện lần lượt bằng máy quét TLC và phần mềm winCATS phiên bản 1.4.0. Phương pháp sắc ký lỏng để định lượng doxycycline được thực hiện bằng cách sử dụng HPLC (Shimadzu, LC-2030 C 3D, Nhật Bản).

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Zi W, Xuejun C. Preparation of core–shell molecular imprinting polymer for lincomycin A and its application in chromatographic column. Process Biochemistry. 2015; 50(7) 1136-1145. DOI10.1016/j.procbio.2015.04.013.
2. Bộ Y tế. Chuyên luận viên nén methyl prednisolon. Dược điển Việt Nam V tập 1. Tái bản lần thứ 5. Bộ Y tế; 2017: 635-636.
3. Serni, E. Pistelli, L.  Bertoli, A. Comparison between thin-layer chromatography and overpressured layer chromatography fingerprints of commercial essential oils and accelerated solvent extraction plant extracts. Akademiai Kiado ZRt. 2021;  34(2), 113-120.
4. Lensi, K. Thomas, L. Ariaya, H. Ayenew, A. High performance thin layer chromatography (HPTLC) method development and validation for determination of doxycycline hyclate in capsule and tablet formulations. Acta Chromatographica. 2022; 34(3), 287–295. Online ISSN: 2083-5736.

BM. HÓA PHÂN TÍCH – KIỂM NGHIỆM